高效毛细管电泳法测定羟基喜树碱及其相关物质的含量天长

高效毛细管电泳法测定羟基喜树碱及其相关物质的含量

高效毛细管电泳法测定羟基喜树碱及其相关物质的含量 2011： 摘要：目的建立一种用高效毛细管电泳法测定羟基喜树碱及其相关物质的舍量的方法。方法以35mmol/L 的硼砂溶液(pH 7.5)作为运行缓冲液；未涂县熔融石英毛细管柱为57cm×μ75m徂，有效长度为50cm；进样压力为.5psi，进样时间为3s；运行电压为18kV；分离温度为20℃：检测波长为254nrno以拓扑替康为内标。测定羟基喜树稿．。结果所确定的实验条件可使羟基喜树碱与其相关物质得到令人满意的分离。结论本方法简单、高效，可有效地控制羟基善树碱的质量。关键词：高效毛细管电泳法 羟基喜树碱 相关物质

羟基喜树碱(Hydr0xycampt0thecin)是我国特有的珙桐科乔木—喜树种子中分离提取的一种微量生物碱，系目前从喜树中得到的20多个单体中抗癌作用最强的化合物。本品抗癌机制与其它抗肿瘤药不同，系通过选择性的抑制拓扑异构酶I(Topp1)，干扰DNA的复制，促使癌细胞的死亡，从而达到抗癌的目的。其具有高效、低毒、广谱抗癌的特 ，在临床上用于膀胱癌、直肠癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、白血病及头颈部肿瘤等的治疗田。喜树碱(camptothecin)与羟基喜树碱的差别就在于1O位碳上连接的是氢而非羟基，它是羟基喜树碱的相关物质，其毒性较羟基喜树碱的大。羟基喜树碱原料及其制剂含量测定方法通常为紫外分光光度法日。该法专属性不强，含量测定结果常常偏高。为此，人们相继用高效液相色谱法、高效毛细管区带电泳法测定其含量，使其质量得到了有效地控制。本文以10-羟基_9一二甲氨基亚甲基喜树碱为内标，用高效毛细管电泳法测定羟基喜树碱及其相关物质的含量。1 仪器与试药1．1 仪器：美国Beckman P／ACE 5010型毛细管电泳仪、固定波长紫外检测器及P／ACE数据工作站；河北永年光导纤维厂未涂渍的熔融石英毛细管，57cmx75μm i．d，有效长度为50cm；日本SIBATA SU－－6THE超声波清洗器。1．2 试剂和药品：羟基喜树碱和喜树碱对照品均由中科院上海药物研究所提供，盐酸拓扑替康对照品由重庆润康药业有限公司提供；羟基喜树碱原料药(01批、02批和O3批)及其粗品由某药厂提供；所用试剂均为国产分析纯试剂；试验用水为三蒸水。2 实验方法2．1 溶液的配制2．1．1 对照品贮备液的配制：精密称取羟基喜树碱对照品适量，用甲醇溶解并制成均含25mg/L 的溶液，作为对照品贮备液。2．1．2 内标贮备液的配制：精密称取盐酸拓扑替康对照品适量，用甲醇溶解并制成含25mg/L的溶液，作为内标贮备液。2．1．3 供试品溶液的配制2．13．1 测定含量用：精密称取羟基喜树碱原料药适量，用甲醇溶解并制成含25mg/L的溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加内标贮备液5．0ml，加甲醇至刻度，摇匀，作为测定含量用的供试品溶液。2．1．3．2 测定有关物质用：精密称取羟基喜树碱原料药(粗品)适量，用甲醇溶解并制成含100mg/L的溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇至亥0度，摇匀，作为测定有关物质用的供试品溶液。2．2 电泳条件：以35mmol/L的硼砂水溶液(用稀盐酸调节pH值至7.5)作为运行缓冲液；运行电压为18kV；检测波长为254nm；工作温度为20℃；进样压力为0.5psi ，进样时间为3s,每次开机后，依次用lmol/L氢氧化钠溶液及水冲洗毛细管2min，2次进样之间均用缓冲液清洗毛细管2min，以获得更好的重现性。上述各个溶液在使用前均需经0．45μm微孔滤膜滤过并超声脱气。3 实验方法的验证与结果3．1 线性关系和灵敏度3．1．1 线性试验：精密量取对照品贮备液lml、2ml、3ml、5ml、10ml和15ml，分别置25ml量瓶中，各加内标贮备液5．0ml，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，依2．2项下的电泳条件进行测定。以羟基喜树碱与盐酸拓扑替康峰面积之比为纵坐标标(Y)，羟基喜树碱的浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，经回归分析，得线l生方程为：Y=1．1 83X+1．43x10-2．r=0．9991。结果表明，在1-15lμg/ml 范围内，羟基喜树碱与盐酸拓扑替康峰面积之比和羟基喜树碱浓度呈现良好的线性关系。3．1．2 灵敏度试验：精密量取对照品贮备液lml，用甲醇稀释成与信噪比为3时的电泳谱峰相应的含羟基喜树碱浓度之溶液。结果表明，最低检出浓度为0．5 μg/ml 。3．2 精密度和稳定性3．2．1 精密度试验：分别精密量取浓度为25 mg/ml的供试品溶液2m]、5m]、lOml，分别置25ml量瓶中，各加内标贮备液5．0ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。依3．1．1项下的方法制备标准曲线，再依2．2项下的电泳条件进行测定，将测得的供试液与内标液峰面积之比代人标准曲线求得供试液的实际含量 同一浓度的被测溶液每天测定5次，共测定5天得到如表1所示的结果。3．2．2 稳定性试验：精密量取精密度试验用的浓度为5μg/ml 的供试液，在避光、室温条件下放置0、1、3,5、8h后依法进行测定。结果表明，本溶液在5h内稳定测得浓度为4．892±0．02531μg/ml,RSD为2．68％。33 回收率实验：精密量取浓度为25mg/ml的供试品溶液2ml，置25ml量瓶中，加内标贮备液5．0ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试液。依3．1．1项下的方法制备标准曲线，再依2．2项下的电泳条件测定上述供试液，将测得的供试液与内标液峰面积之比代人标准曲线求得供试液的实际含量。分别精密量取已测定含量的供试液2ml，置不同的25ml量瓶中，分别加内标贮备液5．0ml和对照品贮备液2．0、5．0、10．0ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，依法测定，计算回收率。每个浓度分别测定3次。3．4．1 粗品的测定结果：取由羟基喜树碱粗品制得的测定有关物质用的供试品溶液，依2．2项下的电泳条件进行测定，适宜的调整检测灵敏度，使有关物质峰均能显现，记录电泳谱图至主成分峰保留时间的2倍。其典型HPCE图谱见图2。由该图可见，本文建立的方法可使羟基喜树碱与其相关物质达到基线分离。3．4．2 有关物质的测定结果：取由羟基喜树碱原料药制得的测定有关物质用的供试品溶液，依2.2项下的电泳条件进行测定适宜的调整检测灵敏度，使有关物质峰均能显现，记录电泳谱图至主成分峰保留时间的2倍。按峰面积归—化法计算有关物质的含量。4 实验方法的确定4．1 检测波长的确定：该仪器仅带有200、214、254和280nm四个波长的滤光片。为了提高检测灵敏度，本实验选定检测波长为214nm。实验证明，在该波长处不干扰羟基喜树碱及其相关物质的测定。4．2 缓冲液的确定4．2．1 缓冲液的组成：本实验分别对碳酸盐缓冲系统、硼酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、磷酸盐—硼酸盐缓冲系统对羟基喜树碱与其相关物质的分离效果进行了6研究。结果表明，碳酸盐和磷酸盐缓冲系统均不能达到预期的分离效果；硼酸盐和磷酸盐硼酸盐缓冲系统在优化的条件下均可使羟基喜树碱与其7种相关物质得到基线分离，但磷酸盐硼酸盐缓冲系统会使体系的电流增大，反映到电泳谱图上就是使谱峰加宽，理论塔板数较小。因此，本实验以硼酸盐缓冲系统作为背景电解质。4．2．2 缓冲液的浓度：实验证明，缓冲液浓度在一定的范围内(10-40mmol/l)对分离效果影响较大，提高浓度会使分离时间延长，有利于分离反映到电泳谱图上就是使谱峰的个数增加。反之，则使分离效果降低，谱峰个数减少。进一步加大缓冲液的浓度会使焦耳热增大，不利于分离。经实验，选定缓冲液的浓度为35 mmol/l 。4．23 缓冲液的pH值：分离生物碱通常采用毛细管区带电泳分离模式在合适的pH缓冲液条件下使生物碱在缓冲液中部分带正电荷，并基于质荷比的不同而实现分离。为此，本实验就pH4．0～9．5的缓冲系统对分离效果的影响进行了考察。结果表明，在酸I生pH值下，物质的迁移时间有延长、谱峰有展宽的趋势；在较强碱l生条件下，电渗流加大，物质的迁移速度过陕，影响分离效果。经实验，选定缓冲液的pH值为7.5。在该条件下，羟基喜树碱与其相关物质可达到基线分离，且出现蝴普峰数目最多。4．3 分离电压的确定：在毛细管区带电泳中，电压升高，电渗迁移速度增大，组分迁移时间缩短。但如果电压过高，就会产生过多的焦耳热，使区带展开显著，降低柱效和分离效率，而目还易在毛细管内形成气泡，使分离无法进行。故此，分离电压的确定是非常重要的。经实验，选分离电压为18kV。在此条件下，分离效率较高，分析时间较短。44 溶媒的确定：羟基喜树碱难溶于水而微溶于甲醇等有机溶剂。另外，甲醇在该电泳体系中可起到改善峰形的作用。故此，选用甲醇作为溶解试样的溶剂。4．5 其他：羟基喜树碱遇光易分解，在实验过程中需避光。从稳定性实验结果可知，随着放置时间的增加，含量有下降的趋势。因此，制备样品和对照品溶液后应在5日内测定完毕。5 小结 本实验应用毛细管区带电泳对羟基喜树碱原料药进行测定，具有快速、分离效率高等特点，可用于该药物的质量控制。

参考文献[1]陈新谦，金有豫，新编药物学，第14版【M】，北京：人民卫生出版社．1997,521"-522[2]湖北省卫生厅，湖北省药品标准，1

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